Оценка применимости крови в качестве материала для определения энтеровирусов методом ПЦР у детей с лихорадкой неясного генеза, сепсисоподобным синдромом или подозрением на менингит: проспективное многоцентровое наблюдательное когортное исследование

Автор: Jérémy Lafolie, André Labbé*, Anne Sophie L’Honneur*, Fouad Madhi, Bruno Pereira, Marion Decobert, Marie Noelle Adam, François Gouraud, Frédéric Faibis, Francois Arditty, Stéphanie Marque-Juillet, Marie Aline Guitteny, Gisele Lagathu, Matthieu Verdan, Flore Rozenberg, Audrey Mirand, Hélène Peigue-Lafeuille, Cécile Henquell†, Jean-Luc Bailly†, Christine Archimbaud

Lancet Infect Dis 2018; 18: 1385-96 

Источник: dx.doi.org S1473 3099(18)30479-1

Опубликовано онлайн 30 октября 2018 г. 

• Университет Клермон-Овернь, Национальный центр научных исследований, лаборатория микробиологических исследований: геном и окружающая среда, Клермон-Ферран, Франция 
• Университетский больничный центр Клермон-Ферран, лаборатория вирусологических исследований, Национальная коллекция эталонных штаммов энтеровирусов и пареховирусов 
• Отделение педиатрии, и подразделение клинических исследований и инноваций, методологии, биостатистики и управления данными, Клермон-Ферран, Франция 
• Межобщинный больничный центр Кретёй, отделение общей педиатрии, Кретёй, Франция 
• Больница Кошин, Общественные парижские больницы, вирусологическое отделение, Париж, Франция 
• Группа больниц северной части Эссонна, отделение педиатрии и неонатологии, Орсей, Франция 
• Больничный центр Южной Франции, лаборатория микробиологических исследований, Корбей-Эссонн, Франция 
• Медицинское объединение восточной Франции, отделение педиатрии 
• Лаборатория микробиологических и иммунологических исследований, Мо, Франция 
• Версальский больничный центр им. Андре Миньо, отделение педиатрии и отделение биологических исследований, подразделение микробиологии, Ле-Шене, Франция 
• Больница Юга, Университетский больничный центр Ренна, отделение педиатрии и лаборатория вирусологических исследований, Ренн, Франция

Резюме

Предпосылки для проведения исследования: Энтеровирусы являются наиболее частой причиной развития острого менингита и все чаще выявляются при сепсисоподобном синдроме и лихорадке неясного генеза у детей. «Золотым стандартом» диагностирования энтеровирусов является их определение методом ПЦР в образцах спинномозговой жидкости (СМЖ). Наша цель состояла в том, чтобы оценить методику определения энтеровирусов в образцах крови при помощи ПЦР.

Методы: Нами было проведено проспективное многоцентровое наблюдательное исследование в 35 отделениях педиатрии и неотложной помощи в 16 больницах на территории Франции. В исследование включали новорожденных (в возрасте ≤ 28 суток) и младенцев (в возрасте> 28 суток, но ≤ 2 лет) с лихорадкой неясного генеза, сепсисоподобным синдромом или подозрением на менингит, а также детей дошкольного и школьного возраста (в возрасте> 2 лет, но ≤ 16 лет) с подозрением на менингит, которые были госпитализированы в больницы, включенные в программу. Мы использовали стандартизированную форму для получения обезличенных демографических, клинических и лабораторных данных. Материалом для ПЦР-теста на энтеровирусы служили образцы крови и СМЖ.

Результаты: В период с 1 июня 2015 г. по 31 октября 2015 г. и с 1 июня 2016 г. по 31 октября 2016 г. в исследование было включено 822 пациента, из которых 672 прошли ПЦР-тест на энтеровирусы в образцах крови и СМЖ. По результатам анализа крови, СМЖ или обоих типов материала энтеровирусы были обнаружены у 317 (47 %) пациентов (71 новорожденный, 83 младенца и 163 ребенка дошкольного и школьного возраста). По итогам сопоставления результатов анализа крови и СМЖ частота обнаружения энтеровирусов в образцах крови была выше у новорожденных (70 (99 %) из 71 и 62 (87 %) из 71; p = 0,011) и младенцев (76 (92 %) из 83 и 62 (75 %) из 83; p = 0,008), но ниже у детей дошкольного и школьного возраста (90 (55 %) из 163 и 148 (91 %) из 163; p < 0,0001). У детей в возрасте 2 лет и младше частота обнаружения энтеровирусов в крови была выше, чем в СМЖ в следующих случаях: при лихорадке неясного генеза (55 (100 %) из 55 и 41 (75 %) из 55; p = 0,0002) и сепсисоподобном синдроме (16 (100 %) из 16 и 9 (56 %) из 16; p = 0,008). Среди пациентов с подозрением на менингит частота обнаружения энтеровирусов в крови была ниже, чем в СМЖ (165 (67 %) из 246 и 222 (90 %) из 246; p <0,0001).

Интерпретация результатов: ПЦР-тест на энтеровирусы в крови должен стать обязательной частью протокола оказания медицинской помощи детям в возрасте 2 лет и младше. Этот тест может сократить время пребывания в стационаре и уменьшить воздействие антибиотиков у пациентов с низким риском, поступивших в отделение неотложной помощи в лихорадочном состоянии.

Финансирование: Университетская больница Клермон-Феррана.

Объект авторского права: © «Элсевье Лтд.», 2018 г. Все права защищены.

Вводная информация

Энтеровирусы являются наиболее частой причиной развития асептического менингита у детей и отмечаются более чем в 75 % случаев вирусного менингита, когда микроорганизм был идентифицирован.^1,2 Определение энтеровирусов методом ПЦР-РВ в образцах спинномозговой жидкости (СМЖ) рекомендуется для диагностики энтеровирусного менингита.^3-5 В практике педиатров также распространены случаи лихорадки неясного генеза или сепсисоподобных синдромов у младенцев. Эти лихорадочные состояния составляют 3,4–13,6 % из всех случаев, наблюдаемых в отделениях неотложной помощи.⁶ Симптомы могут быть вызваны либо тяжелой бактериальной инфекцией, требующей госпитализации и эмпирического лечения антибиотиками, либо, что более вероятно, доброкачественной и самопроизвольно разрешающейся вирусной инфекцией, поэтому установление диагноза затруднено. Для ускорения диагностирования состояний, связанных с энтеровирусными инфекциями, необходимы дополнительные молекулярные анализы.⁵ Образцы крови как материал для исследования рассматривались в ходе нескольких исследований^7-12, но оценка в большой когорте пациентов детского возраста еще не проводилась.

Цель настоящего многоцентрового исследования состояла в том, чтобы оценить применимость образцов крови в качестве материала для определения энтеровирусов методом ПЦР у новорожденных, младенцев и детей дошкольного и школьного возраста с лихорадкой неясного генеза, сепсисоподобным синдромом или подозрением на менингит.

Исследование в контексте

Данные, имевшиеся на начало исследования

Среди публикаций, размещенных в базе данных PubMed по состоянию на 7 февраля 2018 г., искали работы, в которых упоминалось развитие энтеровирусных заболеваний у детей и ПЦР-тест на энтеровирусы или молекулярная диагностика вирусов в образцах спинномозговой жидкости (СМЖ) или крови пациентов с асептическим менингитом, сепсисом, сепсисоподобным синдромом или лихорадкой неясного генеза. Использовали следующие поисковые запросы: «энтеровирус», «энтеровирус не полиовирусной природы», «менингит», «вирусный менингит», «асептический менингит», «энтеровирусный менингит», «острый менингит», «сепсис», «сепсисоподобный синдром», «лихорадка», «лихорадка неясного генеза», «определение генома», «определение энтеровирусов», «ПЦР-РВ на энтеровирусы», «молекулярные методы определения», «виремия», «виремический», «вирусная нагрузка», «кровь», «плазма крови» и «спинномозговая жидкость». Мы также рассмотрели ссылки из соответствующих статей, не идентифицированных в ходе исходного поиска. По результатам поиска выявлено 12 исследований, в которых сообщалось об определении энтеровирусов в крови и СМЖ. Большинство исследований были ретроспективными, число включенных пациентов варьировало от 11 до 34, при этом списки пациентов с результатами анализа СМЖ и лиц, у которых были взяты образцы крови, совпадали частично. При обсуждении частоты обнаружения энтеровирусов в крови и СМЖ младенцев в лихорадочном состоянии мы ссылались на два исследования с участием 80 и 122 пациентов с энтеровирусной инфекцией в возрасте не старше 90 суток. В одном из исследований у 76 % из 75 пациентов с асептическим менингитом в возрасте не старше 16 лет энтеровирусы были обнаружены в образцах крови методом ПЦР. Однако в этом исследовании не проводился анализ по возрастным группам. Во всех этих исследованиях продолжительность симптомов до люмбальной пункции или венепункции и время между взятием образцов СМЖ и крови не регистрировались.

Дополнительная ценность настоящего исследования

Настоящее исследование, в ходе которого у 360 пациентов результаты клинико-лабораторного анализа подтвердили энтеровирусную инфекцию, насколько нам известно, является крупнейшим проспективным многоцентровым наблюдательным исследованием, направленным на сопоставление ценности образцов крови и СМЖ в качестве материала для определения энтеровирусов методом ПЦР у новорожденных (в возрасте ≤ 28 суток) и младенцев (в возрасте > 28 суток, но ≤ 2 лет) с лихорадкой неясного генеза, сепсисоподобным синдромом или подозрением на менингит, а также у детей дошкольного и школьного возраста (> 2 лет, но ≤ 16 лет) с подозрением на менингит. Насколько нам известно, это первое исследование, результаты которого указывают на зависимость чувствительности определения энтеровирусов в образцах крови от возраста пациента и особенностей клинической картины. По итогам сопоставления результатов анализа крови и СМЖ частота обнаружения энтеровирусов в образцах крови была выше у новорожденных и младенцев с лихорадкой неясного генеза или сепсисоподобным синдромом, но ниже у пациентов с подозрением на менингит. Кроме того, в ходе настоящего исследования было установлено, что вероятность положительного результата теста на энтеровирусы в крови была обратно пропорциональна возрасту пациента с менингитом.

Практическая применимость всех имеющихся данных

На данный момент стандартный протокол ведения пациентов в лихорадочном состоянии, поступивших в детское отделение неотложной помощи, не предусматривает взятия образцов крови для ПЦР-теста на энтеровирусы: предусмотрено только взятие образца СМЖ у младенцев младше 90 суток и у пациентов с подозрением на менингит. Клинические рекомендации по ведению пациентов в возрасте 2 лет и младше с лихорадкой в отделении неотложной помощи должны быть пересмотрены в части анализа бионагрузки. Следует одновременно брать два образца крови: для полного анализа и, в отдельную пробирку, для ПЦР-теста на энтеровирусы, который в настоящее время необходимо выполнять достаточно быстро для того, чтобы оказать реальное влияние на лечение инфекции. Внедрение анализа крови методом ПЦР в стандартную практику может увеличить точность выявления энтеровирусов у пациентов с подозрением на менингит, сепсисоподобным синдромом и лихорадкой неясного генеза. Обнаружение энтеровирусов может повысить качество врачебных решений за счет уменьшения антибиотико- или противовирусной терапии, устранения необходимости в дополнительных тестах, сокращения затрат на стационарное или амбулаторное лечение и ускорения выписки.

Методы

Дизайн исследования и пациенты

Нами было проведено проспективное многоцентровое наблюдательное исследование в 35 отделениях педиатрии и неотложной помощи в 16 больницах, расположенных на территории Франции. Мы ограничили период набора пациентов сезонным периодом повышенной циркуляции энтеровирусов в странах с умеренным климатом.¹³

В исследование включали новорожденных (в возрасте ≤ 28 суток) и младенцев (в возрасте> 28 суток, но ≤ 2 лет) с лихорадкой неясного генеза, сепсисоподобным синдромом или подозрением на менингит, а также детей дошкольного и школьного возраста (в возрасте> 2 лет, но ≤ 16 лет) с подозрением на менингит. Каждый участник был госпитализирован в одну из больниц, включенных в программу. Нам требовался образец крови с ЭДТА (плазма), полученный с помощью венепункции. Кроме того, при наличии клинических показаний выполняли люмбальную пункцию.

Лихорадку неясного генеза определяли, как сохранение у ребенка дошкольного или школьного возраста температуры тела 38 °C и выше в течение менее 7 суток, если по итогам ознакомления с историей болезни и физикального осмотра установить причину лихорадки не представлялось возможным.¹⁴ Сепсис определяли, как возможное или подтвержденное наличие инфекции при соответствии как минимум двум из четырех следующих критериев: аномальная температура (> 38,5 или < 36 °C), аномальное число лейкоцитов (повышенное (> 20 000 × 10⁹ на л) или пониженное (< 4 000 × 10⁹ на л) относительно возрастной нормы), нарушение частоты сердечных сокращений (тахикардия или брадикардия) или тахипноэ. Кроме того, в качестве критериев сепсиса рассматривали число тромбоцитов ниже 100 000 × 10⁹ на л и содержание С-реактивного белка на уровне более 15 мг/л.¹⁵ Менингит определяли как наличие возрастного плейоцитоза или по меньшей мере двух из следующих клинических признаков или симптомов неврологических нарушений: головная боль, ригидность затылочных мышц, светобоязнь, вздутие родничка, повышенная раздражительность, вялость, тошнота, рвота или симптомы Кернига или Брудзинского. Плейоцитоз подтверждали при следующих концентрациях лейкоцитов в мкл СМЖ: новорожденные (в возрасте ≤ 28 суток) — более 19; младенцы (в возрасте 29–56 суток) — десять и более; дети старшего возраста (> 56 суток) — пять и более.¹⁶

Критериями исключения были: отказ родителей подписать форму письменного согласия, отсутствие или недостаточность образцов крови, а также возбудители бактериальных или других вирусных инфекций в образцах крови или СМЖ. Кроме того, исключали пациентов (на более поздней стадии), у которых были диагностированы возбудители инфекции в других образцах биологического материала (например, в моче, носоглоточном аспирате или кале).

Исследование было одобрено французским этическим комитетом (AU1180) под номером 00008526, присвоенным ему экспертным советом организации. Разрешение на использование образцов для клинико-лабораторного исследования получено в устной форме: непосредственно от соответствующего участника исследования старше 8 лет или от родителей или опекунов детей не старше 8 лет.

Материалы и методы

В течение 24 ч с момента госпитализации каждого пациента врач заполнял подробный стандартный опросник о характере и продолжительности симптомов и клинических признаков, развившихся у больного до госпитализации, и о результатах первичного физикального осмотра. Клинико-лабораторные сведения включали в себя дату и время взятия образцов биологических материалов и результаты анализа СМЖ, общего анализа крови, количественного определения C-реактивного белка и других видов анализа на бактериологическую и вирусологическую нагрузку, задокументированные биологами. Под продолжительностью симптома понимали интервал времени между его первым проявлением и проведением венепункции (и люмбальной пункции, если имелись медицинские показания к проведению таковой). Время первого проявления симптома регистрировали как «08:00», «14:00», «20:00» или «02:00», в зависимости от времени сбора данных — утром, днем, вечером или ночью соответственно. Концентрацию белка в СМЖ классифицировали как «нормальная» в следующих случаях: новорожденные (возраст: ≤ 28 суток) — 0,9 г/л; другие (возраст:> 28 суток) — 0,45 г/л и ниже. Определение инфекции мочевыводящих путей у пациентов в состоянии лихорадки проводили с помощью тест-полосок для мочи и подтверждали посевом образцов, полученных из уретральных катетеров. Инфекцию мочевыводящих путей диагностировали как лейкоцитоз (≥ 10⁴ клеток на мл) и клинически значимую бактериемию (≥ 10⁵ колониеобразующих единиц на мл) по итогам бактериального посева мочи. Все образцы подлежали стандартному анализу на бактериальную и вирусную нагрузку в соответствии с местным протоколом в каждой больнице, включенной в программу. Старший педиатр и исследовательская группа изучали окончательный диагноз при выписке.

ПЦР-тест на энтеровирусы в образцах крови и СМЖ проводили в лабораториях микробиологических исследований пяти больниц, включенных в программу: Университетский больничный центр Клермон-Феррана (Клермон-Ферран); Больница Кошина (Общественные парижские больницы, Париж); Медицинское объединение восточной Франции, центр в Мо (Мо); Версальский больничный центр им. Андре Миньо (Версаль); Университетский больничный центр Ренна (Ренн). Использовались коммерческие (Xpert EV, Cepheid, Саннивейл, Калифорния, США (только применительно к образцам СМЖ); Enterovirus R-GENE, bioMerieux, Марси-л'Этуаль, Франция; O-DiaENT, Diagenode, Серен, Бельгия) или собственные наборы для¹⁷ анализа методом ПЦР-РВ. Энтеровирусную инфекцию диагностировали на основании положительных результатов анализа методом ПЦР образца плазмы крови или СМЖ или образцов обоих типов материала. Если результат ПЦР-теста на энтеровирусы был отрицательным, а остаточный объем пробы достаточным, проводили специфический анализ на пареховирусы в крови и СМЖ методом ПЦР-РВ (Parechovirus R-GENE, bioMerieux). Типирование энтеровирус-положительных образцов проводили с помощью Национальной коллекции эталонных штаммов энтеровирусов и пареховирусов (Клермон-Ферран, Франция) путем амплификации и секвенирования первичной структуры капсидного белка VP1.¹⁸

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Stata 13. Для проверки гипотез применяли двусторонние статистические критерии с вероятностью ошибки первого рода α = 0,05. Непрерывные данные представлялись в виде медианы (МКИ) для каждой возрастной группы (новорожденные, младенцы и дети дошкольного и школьного возраста). Оценивали коэффициенты каппа и чувствительность, специфичность и прогностическую значимость (с 95 % ДИ) ПЦР-теста на энтеровирусы в крови и сравнивали результаты со значениями, полученными по итогам анализа СМЖ, чтобы убедиться в пригодности методики для применения по назначению. Оценку степени согласованности по значениям коэффициентов каппа давали в соответствии с рекомендациями: менее 0,2 — ничтожно малая; 0,2–0,4 — низкая или слабая; 0,4–0,6 — умеренная; 0,6–0,8 — существенная или хорошая; более 0,8 — отличная. ¹⁹

Для межгруппового сравнения использовали критерий хи-квадрат или точные критерии Фишера для категориальных переменных, а затем (при необходимости) — процедуру Мараскуило. Для количественных параметров использовали t-критерий Стьюдента или критерий Манна–Уитни, если допущения t-критерия не выполнялись. Мы разработали регрессионную модель для новорожденных и младенцев, чтобы идентифицировать независимые факторы, связанные с виремией, используя поэтапный («шаг вперед» – «шаг назад») подход. Ковариаты были установлены по результатам однофакторного анализа (пороговое р-значение = 0,15) и соответствующим биологическим и клиническим переменным (например, число лейкоцитов в СМЖ, длительность симптомов, тахикардия, артериальная гипотензия, повышенная раздражительность и судороги (поправочные факторы). Уделяли внимание мультиколлинеарности. Результаты выражали как отношение шансов (ОШ) и 95 % ДИ и отражали в виде лесовидных диаграмм.

Нами был проведен анализ чувствительности многофакторного анализа применительно ко всем группам. Кроме того, мы провели анализ чувствительности, чтобы оценить влияние любой неточности при фиксировании родителями даты или времени первого проявления симптома.

Роль источника финансирования

Спонсор не принимал участия в разработке исследования, сборе или анализе данных, интерпретации результатов или составлении отчета. CA и AL имели полный доступ ко всем данным, полученным в ходе исследования, и являлись ответственными за окончательное решение публиковать материал.

Результаты

В период с 1 июня 2015 г. по 31 октября 2015 г., а также с 1 июня 2016 г. по 31 октября 2016 г. были получены данные 916 пациентов, удовлетворявших критериям включения в исследование, из которых 822 были в него включены (рисунок 1). В число участников входили 169 новорожденных (медиана возраста: 19 суток (МКИ: 13–25)), 371 младенец (возраст: 68 суток (МКИ: 44–135)) и 282 ребенка дошкольного и школьного возраста (6 лет (МКИ: 4,8–9,1)). У 94 (56 %) новорожденных и 229 (62 %) младенцев был установлен диагноз «лихорадка неясного генеза»; у 36 (21 %) новорожденных и 52 (14 %) младенцев — «сепсисоподобный синдром»; у 39 (23 %) новорожденных, 90 (24 %) младенцев и 282 (100 %) детей дошкольного и школьного возраста — «подозрение на менингит».
Рисунок 1. Пул пациентов, включенных в исследование

СМЖ — спинномозговая жидкость. *Родители не согласились на участие своего ребенка в исследовании после прочтения информационной брошюры. †Ингибиторы ПЦР присутствовали в либо образцах крови (n = 3), либо в образцах СМЖ (n = 3). Из числа пациентов, у которых ингибиторы ПЦР были обнаружены в крови, у двоих пациентов результат анализа СМЖ был отрицательным (один младенец и один ребенок дошкольного или школьного возраста), а у одного — положительным (новорожденный). Из числа пациентов, у которых ингибиторы ПЦР были обнаружены в СМЖ, у одного пациента результат анализа крови был отрицательным (младенец), а у двух — положительным (новорожденный и младенец). У трех пациентов была энтеровирусная инфекция. Все шесть пациентов были исключены из анализа.

Образцы крови были взяты с помощью венепункции у 822 пациентов (169 новорожденных, 371 младенец и 282 ребенка дошкольного и школьного возраста), а образцы СМЖ — путем люмбальной пункции у 675 пациентов (149 новорожденных, 244 младенца и 282 ребенка дошкольного и школьного возраста). Энтеровирус в образцах СМЖ, крови или обоих типов материала был обнаружен у 360 (44 %) из 822 пациентов, включая 81 (48 %) новорожденного, 116 (31 %) младенцев и 163 (58 %) ребенка дошкольного и школьного возраста. В ходе лечения бактериальные или вирусные инфекции, отличные от энтеровирусной, были диагностированы у 144 (18 %) из 822 пациентов. Бактериальные инфекции были выявлены у 83 пациентов. Инфекции мочевыводящих путей были обнаружены у 76 пациентов (Escherichia coli у 62; Enterococcus spp у пяти; Klebsiella spp у четырех; Proteus mirabilis у двух; Citrobacter koseri у одного; Staphylococcus haemolyticus у одного; Staphylococcus aureus у одного), а инфекции желудочно-кишечного тракта у семи (Salmonella spp у четырех; Campylobacter spp у трех). Вирусы, отличные от энтеровирусов, были обнаружены у 61 пациента. Пареховирусные инфекции человека были обнаружены по итогам анализа крови, СМЖ или обоих типов материала 35 пациентов: возбудители инфекций дыхательных путей в мазках из носоглотки у 17 (риновирус у десяти; респираторно-синцитиальный вирус у четырех; коронавирус у одного; вирус парагриппа у одного; бокавирус у одного); вирусы гастроэнтерита в образцах кала у четырех (ротавирус у двух; аденовирус у двух); другие вирусы у пяти (цитомегаловирус у двух; вирус герпеса человека 6 у трех). У 22 (6 %) из 360 пациентов были выявлены сопутствующие инфекции: энтеровирусные и бактериальные (в основном фебрильные инфекции мочевыводящих путей). Патогенов не было выявлено у 340 (41 %) из 822 пациентов.

Образцы крови и СМЖ для ПЦР-теста были получены у 317 пациентов с энтеровирусной инфекцией (таблица 1; приложение p 1). Результаты ПЦР-теста на энтеровирусы в крови были положительными у 236 (74 %) пациентов, но не были подтверждены по результатам ПЦР-теста СМЖ у 45 (14 %) пациентов. Результаты ПЦР-теста СМЖ на энтеровирусы были положительными у 272 (86 %) пациентов, но не были подтверждены по результатам ПЦР-теста крови у 81 (26 %) пациента. Результаты анализа образцов обоих типов материала были положительными у 191 (60 %) пациента.

При разбивке по возрастным группам частота обнаружения энтеровирусов в образцах крови и СМЖ была разной (таблица 1; приложение р 1). По итогам сопоставления результатов анализа крови и СМЖ частота обнаружения энтеровирусов в образцах крови была выше у новорожденных (70 (99 %) из 71 и 62 (87 %) из 71; р = 0,011) и младенцев (76 (92 %) из 83 и 62 (75 %) из 83; р = 0,008). Среди детей дошкольного и школьного возраста частота обнаружения энтеровирусов в образцах крови была ниже, чем в образцах СМЖ (90 (55 %) из 163 и 148 (91 %) из 163; p <0,0001).

При разбивке с учетом различий по клинической картине частота обнаружения энтеровируса варьировала (таблица 1). По итогам сопоставления результатов анализа крови и СМЖ частота обнаружения энтеровирусов в образцах крови была выше у новорожденных и младенцев с лихорадкой неясного генеза (55 (100 %) из 55 и 41 (75 %) из 55; р = 0,0002) или сепсисоподобным синдромом (16 (100 %) из 16 и 9 (56 %) из 16; р = 0,008). У младенцев и новорожденных с подозрением на менингит статистически значимой разницы между показателями частоты обнаружения энтеровирусов в образцах крови и СМЖ не выявлено (p = 0,317 и p = 0,782 соответственно). Среди детей дошкольного и школьного возраста с подозрением на менингит частота обнаружения энтеровирусов в крови была ниже, чем в СМЖ (90 (55 %) из 163 и 148 (91 %) из 163; p <0,0001). Причина такой более низкой частоты заключалась в большей продолжительности периода между первым проявлением симптомов и венепункцией (медиана: 25 ч (МКИ: 15–49)), чем у младенцев и новорожденных (20 ч (МКИ: 8–32) и 14 ч (МКИ: 5–36) соответственно; р <0,0001). У 144 пациентов (125 младенцев и 19 новорожденных) ПЦР-тест на энтеровирусы провели только на образцах крови (рисунок 1). Из этого числа 124 (86 %) пациента поступили в отделение неотложной помощи с лихорадкой неясного генеза. Результаты ПЦР-теста на энтеровирусы были положительными у 40 (28 %) пациентов (восемь (42 %) из 19 новорожденных и 32 (26 %) из 125 младенцев).

Чувствительность, специфичность и правильность ПЦР-теста на энтеровирусы в образцах крови рассчитывали для трех типов клинической картины, опираясь на результаты ПЦР-теста на энтеровирусы в СМЖ (таблица 2). В рамках данного анализа не учитывали 46 младенцев (в возрасте> 3 месяцев, но <2 лет) с лихорадкой неясного генеза и сепсисом, поскольку ПЦР-тест СМЖ на энтеровирусы не является «золотым стандартом» диагностирования этих заболеваний.

У 165 пациентов с лихорадкой неясного генеза чувствительность и специфичность ПЦР-теста на энтеровирусы в образцах крови составили 100 % (МР: 91–100) и 91 % (МР: 85–96) соответственно. У 55 пациентов с сепсисоподобным синдромом чувствительность составила 100 % (66–100), а специфичность — 89 % (76–96). У 406 пациентов с подозрением на менингит чувствительность по имеющимся данным составила 64 % (57–70), а специфичность — 87 % (81–92).

При возможности анализа как образцов крови, так и образцов СМЖ характеристики пациентов не старше 2 лет, независимо от наличия энтеровирусной виремии, сравнивали без учета особенностей клинического синдрома (таблица 3). В рамках данного анализа не учитывали 112 пациентов в возрасте ≤ 2 лет с бактериальными или вирусными инфекциями, отличными от энтеровирусных, и 19 других пациентов, у которых время между взятием образца СМЖ и крови составляло ≥ 24 ч. Наиболее частым клиническим симптомом, связанным с виремией, была тахикардия, выявленная у 62 (50 %) из 125 пациентов с виремией и у 46 (34 %) из 135 без виремии (р = 0,011). Связь между воздействием на организм пациента при контакте с больным (родители и братья и сестры с инфекционным заболеванием) и виремией была статистически значимой (58 (46 %) из 125 пациентов с виремией и 29 (22 %) из 135 пациентов без виремии; р <0,0001). У пациентов с виремией частота выявления плейоцитоза, число лейкоцитов в СМЖ и количество белка в СМЖ были статистически значимо выше, чем у пациентов без виремии (p ≤ 0,0001) Количество пациентов с плейоцитозом было незначительным (44 (38 %) из 116 пациентов с виремией и 17 (14 %) из 125 пациентов без виремии).

Результаты многофакторного анализа с поправкой на возраст, длительность симптомов, артериальную гипотензию, повышенную раздражительность и все факторы, рассматриваемые как значимые в одномерном анализе, подтвердили, что возраст пациента, тахикардия и контакт с больным оказывает статистически значимое влияние на развитие виремии у пациентов не старше 2 лет (рисунок 2А). Результаты дальнейшего многофакторного анализа, включавшего данные пациентов всех трех возрастных групп, время между первым проявлением симптомов и венепункцией (<24 ч, ОШ 2,96, 95 % ДИ 1,57–5,58, p = 0,001; от 24 ч до <48 ч, 2,55, 1,27–5,11, р = 0,008) и плейоцитозом (7,60, 4,34–13,32, р <0,0001) также были связаны с виремией (рисунок 2В).

Данные пациентов из каждой возрастной группы с энтеровирусной инфекцией и без нее, у которых были взяты образцы для ПЦР-теста, сравнивали на предмет различий по симптомам и клинико-лабораторным характеристикам (таблица 4). В рамках данного анализа не учитывали 144 пациента с бактериальными или вирусными инфекциями, отличными от энтеровирусных. Новорожденные с энтеровирусными инфекциями были статистически значимо младше других представителей возрастной группы (медиана возраста: 18 суток (МКИ: 12–24) с энтеровирусной инфекцией и 21 сутки (14–26) без энтеровирусной инфекции; p = 0,037). Младенцы с энтеровирусными инфекциями были статистически значимо младше других представителей возрастной группы (медиана возраста: 51 сутки (МКИ: 40–86] и 77 суток (53–261); p = 0,0001). У детей дошкольного и школьного возраста с энтеровирусной инфекцией головная боль, ригидность затылочных мышц, артериальная гипотензия и тошнота или рвота наблюдались статистически значимо чаще, чем у других представителей возрастной группы (р = 0,015, р = 0,042, р = 0,012 и р <0,0001 соответственно).

Рисунок 2. Лесовидная диаграмма по итогам многофакторного анализа взаимосвязи между энтеровирусной виремией и клинико-биологическими характеристиками пациентов

Проведен анализ данных пациентов (A) не старше 2 лет и (B) не старше 16 лет, у которых были взяты как образцы крови, так и образцы СМЖ. СМЖ — спинномозговая жидкость.

Независимо от возраста пациенты с энтеровирусной инфекцией чаще вступали в контакт с больными, чем неинфицированные пациенты (p ≤ 0,003). У новорожденных с энтеровирусной инфекцией симптомы повышенной раздражительности и артериальной гипотензии чаще проявлялись, чем при отрицательных результатах теста (р = 0,001 и р = 0,033 соответственно). У младенцев с энтеровирусной инфекцией тахикардия наблюдалась чаще, чем в отсутствии таковой (р = 0,005). У всех больных отмечено излечение от энтеровирусной инфекции.

Плейоцитоз был зарегистрирован у 192 (66 %) из 292 пациентов с энтеровирусной инфекцией и у 59 (24 %) из 246 не инфицированных пациентов (р = 0,0001). Частота выявления плейоцитоза увеличивалась с возрастом пациента: плейоцитоз наблюдался у 20 (35 %) из 58 новорожденных, 33 (47 %) из 71 младенца и 139 (85 %) из 163 детей дошкольного и школьного возраста. В присутствии и в отсутствии энтеровирусов статистически значимой разницы по содержанию белка в СМЖ не выявлено. При энтеровирусной инфекции число лимфоцитов в крови было ниже независимо от возраста пациента (p ≤ 0,044).

Проспективное типирование энтеровирусов было выполнено для 311 (86 %) из 360 пациентов с положительными результатами анализа на энтеровирусы в образцах СМЖ, крови или обоих типов материала (приложение p 2).

Вирусные штаммы были соотнесены с 29 различными типами: восемь представителей видов энтеровируса A (29 пациентов) и 21 представитель видов энтеровируса B (282 пациента). Частота выявления энтеровирусов с генотипами E9, E25, E7 и CVB5 была выше у новорожденных; E25 — у пациентов с подозрением на сепсис; E30, E6 и CVB5 — у пациентов с подозрением на менингит.

Обсуждение

Результаты исследования свидетельствуют о том, что у новорожденных и младенцев ПЦР-тест на энтеровирусы более чувствителен при использовании в качестве исследуемого материала крови, а не СМЖ. Эти данные подтверждают результаты предыдущих одноцентровых исследований^7-9 и обосновывают применение анализа крови на энтеровирусы в качестве диагностического инструмента для быстрой идентификации таких новорожденных и младенцев с лихорадкой неясного генеза, сепсисоподобным синдромом или подозрением на менингит на момент поступления, у которых лечение антибиотиками можно прекратить и которых можно выписать. Результаты исследования также указывают на отсутствие каких-либо преимуществ использования крови, а не СМЖ в качестве материала для ПЦР-теста на энтеровирусы у детей с подозрением на менингит.

Эта более низкая чувствительность, чем у новорожденных и младенцев объяснялась главным образом длительным периодом между первым проявлением симптомов и венепункцией.

Насколько нам известно, в настоящей публикации описывается наикрупнейшее проспективное многоцентровое наблюдательное исследование, направленное на то, чтобы доказать, что вероятность обнаружения энтеровирусов в крови связана с возрастом пациента и клинической картиной заболевания. Среди новорожденных и младенцев частота обнаружения энтеровирусов в образцах крови была статистически значимо выше, чем в образцах СМЖ. При этом она варьировала в зависимости от клинической картины: при лихорадке неясного генеза или сепсисоподобном синдроме частота обнаружения энтеровирусов в образцах крови была выше, чем при подозрении на менингит. Частота положительных результатов анализа образцов крови на энтеровирусы при подозрении на менингит была обратно пропорциональна возрасту: у новорожденных она составляла 97 %, у младенцев — 87 %, у детей дошкольного и школьного возраста — 55 %.

В данном исследовании частота обнаружения энтеровирусов в образцах крови новорожденных и младенцев была выше по сравнению с предыдущими отчетами. В исследовании у 122 младенцев (в возрасте ≤ 90 суток) с лихорадкой и энтеровирусной инфекцией частота положительных результатов ПЦР-теста была сопоставимой при использовании образцов крови и СМЖ (77 и 83 % соответственно).⁷ В другом исследовании у 80 младенцев с подозрением на сепсис не было выявлено статистически значимых различий с точки зрения частоты выявления энтеровирусов в крови и СМЖ (69 и 78 % соответственно).⁸

Данное исследование проводилось в соответствии с руководством Национального института здравоохранения и качества медицинской помощи Великобритании по ведению новорожденных, младенцев и детей дошкольного и школьного возраста с лихорадкой в отделениях неотложной помощи,²⁰ которое предусматривает анализ на бионагрузку, в частности, полный анализ крови, анализ мочи и люмбальную пункцию при наличии медицинских показаний.

Для проведения данного исследования требовалась дополнительная пробирка с образцом крови для проведения ПЦР-теста на энтеровирусы. У большинства пациентов время между взятием образца крови и СМЖ составляло 2 ч или меньше (472 (70 %) из 672; данные не приводятся). Одновременность сбора крови и СМЖ была важна для общей интерпретации вирусологических данных. Нами было установлено, что время взятия образцов СМЖ и крови после первого проявления симптомов оказывало существенное влияние на выявление энтеровирусов: результаты анализа ликвора, полученного методом люмбальной пункции на ранней стадии развития инфекции, и поздно взятого образца крови (> 3, но ≤ 4 суток) могут быть отрицательными. В данном исследовании у 45 (14 %) из 317 пациентов с энтеровирусной инфекцией, у которых брали образцы и крови и СМЖ, результаты анализа СМЖ методом ПЦР были отрицательными. Промежуток времени между первым проявлением симптомов и люмбальной пункцией у этих пациентов был коротким (медиана: 15 ч (МКИ: 8–23)), при этом у 14 (31 %) из этих 45 пациентов продолжительность периода проявления симптомов не превышала 8 ч (данные не приводятся). Если результаты анализа СМЖ методом ПЦР были положительными, а крови — отрицательными (у 81 (26 %) из 317 пациентов), наблюдалась обратная картина: время между первым проявлением симптомов и венепункцией было больше (медиана: 26 ч (МКИ: 16–70)). Эти данные свидетельствуют о том, что виремия возникает рано и протекает быстро, что редко отмечается в других отчетах, а если и указывается, то на примере небольших групп пациентов.^21,22

Некоторые протоколы оценки бионагрузки предусматривают анализ СМЖ методом ПЦР только у пациентов с плейоцитозом. В ходе данного исследования люмбальную пункцию провели у 675 пациентов, из которых у 371 пациента плейоцитоза не было (данные не приводятся). Однако у этих пациентов энтеровирус был обнаружен в СМЖ (n = 70) и крови (n = 98). Если бы энтеровирус в образцах крови или СМЖ обнаружен не был, этих пациентов без плейоцитоза были бы выписаны без этиологического диагноза. Таким образом, ограничение круга пациентов, которым показан тест на энтеровирусы, лицами с плейоцитозом может привести к невыявлению случаев энтеровирусной инфекции. Кроме того, у 144 пациентов ПЦР-тест на энтеровирусы был проведен с использованием только образцов крови, и у 40 из них (28 %) наличие энтеровирусной инфекции подтвердилось, в основном у новорожденных или младенцев с лихорадкой неясного генеза. Ahmad и соавт, обнаружили энтеровирус в образцах крови у 34 (24 %) из 139 новорожденных с сепсисоподобным синдромом.¹¹

Разнообразие преобладающих генотипов энтеровирусов в течение двух сезонов, охваченных данным исследованием, и различия в распределении генотипов по возрастным группам и типам клинических проявлений — все это факторы, которые следует учитывать при определении энтеровирусов в образцах крови.

Доля генотипов энтеровирусов у пациентов, поступивших в больницы, отражает глобальные схемы циркуляции вирусных штаммов в разных странах и в общей популяции одной страны.²³ Harvala и соавт.²⁴ сообщали, что результаты оценки вирусной нагрузки путем анализа СМЖ 11 детей младше 3 лет с заболеваниями ЦНС были выше или статистически значимо не отличались от результатов соответствующего анализа плазмы крови в этой же популяции. Согласно полученным ими результатам, у 14 детей с сепсисом вирусная нагрузка была низкой или не поддавалась определению по итогам анализа СМЖ и высокой по итогам анализа плазмы крови. Согласно результатам анализа СМЖ 156 пациентов с острым менингитом в рамках предыдущего исследования, проведенного нашей группой,²⁵ у новорожденных нагрузка энтеровирусом была выше, чем у младенцев и взрослых, а генотипы были связаны со уровнями вирусной нагрузки.

По итогам анализа клинических и биологических характеристик пациентов не старше 2 лет показано, что виремия чаще выявлялась у младенцев на более ранних порах жизни (медиана: 28 суток (МКИ: 17–41)) в острой стадии заболевания, как предполагалось в более ранних ретроспективных исследованиях в меньших популяциях пациентов.^21,22 Клинические признаки тахикардии присутствовали у 62 (50 %) из 125 молодых пациентов с виремией и лихорадкой неясного генеза, сепсисом или подозрением на менингит. В других сообщениях упоминалось, что у пациентов с энтеровирусной виремией наблюдаются лихорадка, повышенная раздражительность, вялость и слабый аппетит.^11,21 Кроме того, согласно результатам нашего исследования, пациенты с энтеровирусной виремией чаще контактировали с больными.

У всех пациентов с виремией, включенных в данное исследование, наблюдалась лихорадка. С-реактивный белок в количестве более 15 мг на л сыворотки крови чаще определяли у пациентов без виремии. Плейоцитоз был отмечен у 44 (38 %) из 116 пациентов с энтеровирусной виремией, главным образом у лиц с подозрением на менингит (данные не приводятся). Dagan и соавт.²¹ сообщали об обратной связи между виремией и плейоцитозом. У пациентов с виремией число лимфоцитов и моноцитов было статистически значимо ниже, чем у пациентов без виремии. Эти и более ранние данные^21,26 свидетельствуют об угнетающем воздействии энтеровирусной инфекции на популяции одноядерных лейкоцитов при виремии. Этот эффект может обусловливаться репликацией вируса в одноядерных лейкоцитах, поскольку некоторые генотипы энтеровирусов могут реплицироваться in vitro в одноядерных клетках периферической крови человека.^27,28 Соответственно, концентрации циркулирующих одноядерных клеток в организме лиц разного возраста и способность генотипов энтеровирусов реплицироваться в этих клетках могут влиять на чувствительность определения энтеровирусов в крови.

Сопутствующие бактериальные инфекции, в основном инфекции мочевыводящих путей, имели место у небольшой части (22 (6 %) из 360) пациентов с лихорадкой и энтеровирусной инфекцией. С-реактивный белок в количестве более 15 мг на л сыворотки крови отмечался у пяти (23 %) из этих пациентов (данные не приводятся). Частота сопутствующих энтеровирусных и бактериальных инфекций согласовывалась с результатами других исследований.7,8,29 В СМЖ пациентов с менингитом и в образцах крови пациентов с сепсисоподобным синдромом сопутствующих энтеровирусных и бактериальных инфекций не выявлено.

Данное исследование имеет три ограничения. Во-первых, регистрация даты и времени первого проявления симптомов родителями детей дошкольного и школьного возраста менее надежна, чем в популяции новорожденных и младенцев. Исключение неточных дат и времени первого проявления симптомов у 190 (23 %) из 822 пациентов с целью анализа чувствительности (данные не приводятся) не повлияло на результаты исследования. Во-вторых, протоколы анализа на вирусную и бактериальную нагрузку (включая определение вирусов, отличных от энтеровирусов) в 16 больницах, включенных в программу, варьировали. У 340 (41 %) из 822 пациентов диагноз не был установлен, и эта цифра аналогична той, что приведена в работе Ahmad и соавт. (43 %).¹¹ В-третьих, в рамках данного многоцентрового исследования использовали четыре различных набора для анализа методом ПЦР-РВ. Маловероятно, что это разнообразие наборов для анализа повлияло на общие результаты исследования, поскольку все используемые методики являются объектами ежегодной программы внешней оценки качества, и дают правильные результаты.

Таким образом, использование крови в качестве материала для определения энтеровирусов вместо СМЖ улучшило точность диагностики инфекции у новорожденных и младенцев, поступивших с лихорадкой неясного генеза, сепсисоподобным синдромом или подозрением на менингит. Высокая частота обнаружения энтеровирусов в образцах крови у пациентов с лихорадкой неясного генеза и сепсисоподобным синдромом на очень ранних этапах жизни указывает на то, что лихорадочные состояния энтеровирусной природы выявляются не во всех случаях. Клинические рекомендации по ведению пациентов в возрасте 2 лет и младше с лихорадкой в отделении неотложной помощи должны быть пересмотрены в части анализа бионагрузки, а именно во время взятия образцов крови нужно предусмотреть подготовку дополнительной пробирки с материалом для ПЦР-теста на энтеровирусы, который необходимо выполнить достаточно быстро для того, чтобы оказать реальное влияние на лечение. Обнаружение энтеровируса в крови может повысить качество врачебных решений за счет уменьшения антибиотико- или противовирусной терапии, устранения необходимости в дополнительных тестах, сокращения затрат на стационарное или амбулаторное лечение и ускорения выписки. Геном энтеровируса в крови также можно использовать в качестве альтернативного биомаркера, если взятие образцов СМЖ противопоказано, а провести люмбальную пункцию не представляется возможным.

Вклад авторов

AL и CA являются главными исследователями. ASL'H, FM, BP, MD, MNA, FG, FF, FA, SM-J, MAG, GL, MV, FR, AM, HP-L, CH и J-LB являются исследователями. CA, AL и JL разработали дизайн исследования и осуществляли надзор за его проведением. CA и JL координировали отдельные исследовательские центры. AL, CA и JL выполняли проверку клинических данных. ASL'H и FR внесли вклад в сбор и компиляцию данных. CA, JL, J-LB и CH анализировали данные и подготовили первый проект статьи. ASL'H, FM, BP, MD, MNA, FG, FF, FA, SM-J, MAG, GL, MV, FR, AM и HP-L выступили в роли критических рецензентов отчета и внесли свой вклад в его содержание. Все авторы и члены исследовательской группы внесли свой вклад в сбор данных и утвердили окончательный вариант статьи перед отправкой.

Заявление о конфликте интересов

Мы заявляем об отсутствии конфликта интересов.

Благодарность

Настоящее исследование проведено в рамках гранта Университетской больницы Клермон-Ферран, полученного по итогам внутреннего тендера среди интернов, 2015 г. Мы выражаем благодарность команде исследователей, изучивших возможность диагностирования энтеровирусной инфекции у детей путем анализа крови и участвовавших в сборе данных в 16 больницах на территории Франции, включенных в программу. Мы благодарим Emilie Leroy и Nathalie Rodde за помощь в генотипировании вирусов, а также Jeffrey Watts за помощь в подготовке статьи (финансируется в рамках гранта Университетской больницы Клермон-Ферран, полученного по итогам внутреннего тендера среди интернов, 2015 г.).

Список литературы

1. de Ory F, Avellón A, Echevarria JE, et al. Viral infections of the central nervous system in Spain: a prospective study. J Med Virol 2013; 85: 554-62.
2. Martin NG, Iro MA, Sadarangani M, Goldacre R, Pollard AJ, Goldacre MJ. Hospital admissions for viral meningitis in children in England over five decades: a population-based observational study. Lancet Infect Dis 2016; 16: 1279-87.
3. Archimbaud C, Chambon M, Bailly JL, et al. Impact of rapid enterovirus molecular diagnosis on the management of infants, children, and adults with aseptic meningitis. J Med Virol 2009; 81: 42-48.
4. Archimbaud C, Ouchchane L, Mirand A, et al. Improvement of the management of infants, children and adults with a molecular diagnosis of enterovirus meningitis during two observational study periods. PLoS One 2013; 8: e68571.
5. Harvala H, Broberg E, Benschop K, et al. Recommendations for enterovirus diagnostics and characterisation within and beyond Europe. J Clin Virol 2018; 101: 11-17.
6. Alpern ER, Stanley RM, Gorelick MH, et al. Epidemiology of a pediatric emergency medicine research network: the PECARN Core Data Project. Pediatr Emerg Care 2006; 22: 689-99.
7. Rittichier KR, Bryan PA, Bassett KE, et al. Diagnosis and outcomes of enterovirus infections in young infants. Pediatr Infect Dis J 2005; 24: 546-50.
8. Byington CL, Taggart EW, Carroll KC, Hillyard DR. A polymerase chain reaction-based epidemiologic investigation of the incidence of nonpolio enteroviral infections in febrile and afebrile infants 90 days and younger. Pediatrics 1999; 103: E27.
9. de Crom SC, Obihara CC, de Moor RA, Veldkamp EJ, van Furth AM, Rossen JW. Prospective comparison of the detection rates of human enterovirus and parechovirus RT-qPCR and viral culture in different pediatric specimens. J Clin Virol 2013; 58: 449-54.
10. de Jong EP, van den Beuken MGA, van Elzakker EPM, et al. Epidemiology of sepsis-like illness in young infants: major role of enterovirus and human parechovirus. Pediatr Infect Dis J 2018; 37: 113-18.
11. Ahmad S, Dalwai A, Al-Nakib W. Frequency of enterovirus detection in blood samples of neonates admitted to hospital with sepsis-like illness in Kuwait. J Med Virol 2013; 85: 1280-85.
12. Cordey S, L'Huillier AG, Turin L, Gervaix A, Posfay Barbe K, Kaiser L. Enterovirus and parechovirus viraemia in young children presenting to the emergency room: unrecognised and frequent. J Clin Virol 2015; 68: 69-72.
13. Antona D, Leveque N, Chomel JJ, Dubrou S, Levy-Bruhl D, Lina B. Surveillance of enteroviruses in France, 2000-2004. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007; 26: 403-12.
14. Baraff LJ. Management of fever without source in infants and children. Ann Emerg Med 2000; 36: 602-14.
15. European Medicines Agency. Report on the Expert Meeting on neonatal and paediatric sepsis. Dec 16, 2010. (accessed Oct 24, 2017).
16. Kestenbaum LA, Ebberson J, Zorc JJ, Hodinka RL, Shah SS. Defining cerebrospinal fluid white blood cell count reference values in neonates and young infants. Pediatrics 2010; 125: 257-64.
17. Dierssen U, Rehren F, Henke-Gendo C, Harste G, Heim A. Rapid routine detection of enterovirus RNA in cerebrospinal fluid by a one-step real-time RT-PCR assay. J Clin Virol 2008; 42: 58-64.
18. Mirand A, Henquell C, Archimbaud C, et al. Prospective identification of enteroviruses involved in meningitis in 2006 through direct genotyping in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol 2008; 46: 87-96.
19. Terwee CB, Bot SDM, de Boer MR, et al. Quality criteria were proposed for measurement properties of health status questionnaires. J Clin Epidemiol 2007; 60: 34-42.
20. National Institute for Health and Care Excellence. Fever in under 5s: assessment and initial management—clinical guideline (CG160). August, 2017. (accessed April 20, 2018).
21. Dagan R, Jenista JA, Prather SL, Powell KR, Menegus MA. Viremia in hospitalized children with enterovirus infections. J Pediatr 1985; 106: 397-401.
22. Cheng H-Y, Huang Y-C, Yen T-Y, et al. The correlation between the presence of viremia and clinical severity in patients with enterovirus 71 infection: a multi-center cohort study. BMC Infect Dis 2014; 14: 417.
23. Santé Publique France. Point sur les infections à entérovirus au 9 décembre 2016. Dec 9, 2016. http://invs.santepubliquefrance.fr/ Dossiers-thematiques/Maladies-infectieuses/Maladies-a- prevention-vaccinale/Poliomyelite/Points-de-situation/Point-sur- les-infections-a-enterovirus-au-9-decembre-2016 (accessed April 20, 2018).
24. Harvala H, Griffiths M, Solomon T, Simmonds P. Distinct systemic and central nervous system disease patterns in enterovirus and parechovirus infected children. J Infect 2014; 69: 69-74.
25. Volle R, Bailly J-L, Mirand A, et al. Variations in cerebrospinal fluid viral loads among enterovirus genotypes in patients hospitalized with laboratory-confirmed meningitis due to enterovirus. J Infect Dis 2014; 210: 576-84.
26. Sharp J, Harrison CJ, Puckett K, et al. Characteristics of young infants in whom human parechovirus, enterovirus or neither were detected in cerebrospinal fluid during sepsis evaluations. Pediatr Infect Dis J 2013; 32: 213-16.
27. Dagan R, Menegus MA. Replication of enteroviruses in human mononuclear cells. Isr J Med Sci 1992; 28: 369-72.
28. Vuorinen T, Vainionpaa R, Heino J, Hyypia T. Enterovirus receptors and virus replication in human leukocytes. J Gen Virol 1999; 80: 921-27.
29. Calvo C, Gallardo P, Torija P, et al. Enterovirus neurological disease and bacterial coinfection in very young infants with fever. J Clin Virol 2016; 85: 37-39.