Многосторонний метаанализ микробиома кишечника при расстройствах аутистического спектра: шаг к пониманию подгрупп пациентов

Scientific Reports | (2022) 12:17034.

doi.org

Multi‑angle meta‑analysis of the gut microbiome in Autism Spectrum Disorder: a step toward understanding patient subgroups

Kiana A. West, Xiaochen Yin, Erica M. Rutherford, Brendan Wee, Jinlyung Choi, Brianna S. Chrisman, Kaiti L. Dunlap, Roberta L. Hannibal, Wiputra Hartono, Michelle Lin, Edward Raack, Kayleen Sabino, Yonggan Wu, Dennis P. Wall, Maude M. David, Karim Dabbagh, Todd Z. DeSantis, Shoko Iwai

Распространенность расстройств аутистического спектра (РАС) продолжает расти, и все больше доказательств указывают на потенциальную роль микробиома кишечника в симптоматике РАС. Основные поведенческие особенности РАС часто сопровождаются множественными сопутствующими заболеваниями, такими как желудочно-кишечная (ЖКТ) и иммунная дисфункция. Высокометаболически активное образование – кишечный микробиом – находится на пересечении многочисленных коммуникационных осей в организме. Он участвует в развитии иммунитета, перепадах настроения и других внежелудочно-кишечных расстройствах. Казалось бы, бесчисленные обсервационные исследования выявили значительную вариабельность в популяциях бактерий и грибков у детей с РАС и нейротипичных детей, но в разных когортах данные не были достоверными. Последовательность в связывании конкретных особенностей или сигнатур с фенотипом РАС на сегодняшний день оказалась бесполезной.

Из-за различной степени поведенческих симптомов и уникального набора клинических особенностей у каждого человека, фенотип РАС чрезвычайно неоднороден. От 40 до 70% детей с РАС имеют аномальное функционирование желудочно-кишечного тракта: запоры и диарею. В то время как было показано, что консистенция стула значительно влияет на наблюдаемый микробный профиль, во многих исследованиях эта переменная не контролируется должным образом. Недавний повторный анализ опубликованного набора данных демонстрирует, что первоначальные результаты были искажены из-за запоров у пациентов с РАС. Кроме того, популяции кишечных микроорганизмов человека сильно колеблются с возрастом, особенно в раннем детстве. РАС обычно диагностируется в течение первых 4 лет жизни. Тем не менее, существуют значительные различия в медианном возрасте прошлых когорт в диапазоне от 3 до 11 лет. В этом исследовании изучаются различия в возрасте испытуемых и несоответствия в сопутствующих заболеваниях между группами случая и контрольной группы, поскольку они, вероятно, способствуют несоответствиям, наблюдаемым в проведенных исследованиях.

Используя ранее опубликованные данные секвенирования микробиома из исследований случай-контроль, мы определили взаимосвязи между конкретными переменными и микробиомами кишечника всех детей с РАС, а также те, которые наблюдались только в подгруппах исследуемых детей. Используя линейные модели смешанных эффектов для метаанализа, мы идентифицировали бактериальные таксоны, дифференциальная численность которых была одинаковой в разных исследованиях. Мы показываем, что возраст, пол и функция кишечника являются важными искажающими факторами, которые должны контролироваться и оцениваться последовательным образом при оценке наборов данных РАС между исследованиями. Далее следует обсуждение и обзор размеров выборки и статистических методов, необходимых для учета этих переменных и, таким образом, более точной оценки эффекта, связанного с РАС. Описанный здесь подход поможет понять гетерогенность групп пациентов, что приведет к выявлению подходящих подгрупп пациентов для предоставления таргетной терапии в будущем.

Методы

Были собраны и повторно проанализированы исходные наборы данных секвенирования (n = 10) из общедоступных исследований типа «случай-контроль». Эти десять наборов данных, представляющих девять различных когорт, оценивались вместе с тремя наборами данных микробиома из внутренней когорты. Наборы данных состояли из ампликона гена 16S рРНК и метагеномных последовательностей ДНК. Кроме того, был сгенерирован один внутренний датасет с помощью технологии PhyloChip. Наборы данных ампликонного секвенирования охватывали несколько вариабельных областей 16S рРНК. Когорты включали субъектов в возрасте от 2 до 18 лет из США, Канады, Китая, Италии и Индии. Сообщалось, что в 7 из 10 исследований участники были сопоставимы по возрасту, хотя в одном исследовании мы обнаружили значительную разницу в возрасте детей с РАС и нейротипичных (НТ)

Обсуждение

Несмотря на убедительные доказательства того, что профили микробиома кишечника различаются у детей с РАС и НТ, нет единого мнения о том, какие бактериальные таксоны оказывают влияние и/или вообще имеют отношение к симптоматике РАС. Независимые исследования дают результаты, которые не могут быть обобщены на популяцию РАС, возможно, из-за гетерогенности фенотипа РАС и вариабельности возраста исследуемых субъектов. Недавние усилия по систематическому обзору инициатив, связывающих микробиом с РАС, и/или проведению метаанализов по сообщенным результатам таких усилий практически не показывают эмпирически полученных связей между различным разнообразием микробиома и фенотипом РАС. Мы предположили, что стандартизированная предварительная обработка исходных данных, полученных в результате обследований микробиома РАС, в сочетании с последующим всесторонним метаанализом приведет к более глубоким и точным результатам. Аналогичным образом мы тщательно исследовали популяции микробиома вместе со всеми метаданными, собранными из многочисленных исследований, чтобы пересмотреть некоторые дифференциальные результаты в подгруппах детей с РАС и НТ. Мы обнаружили, что содержание определенных бактерий значительно различалось между РАС и НТ, что часто является прямым следствием смешанных эффектов дисфункции кишечника, возраста и пола. Наш статистический подход прост, а результаты можно интерпретировать напрямую, что делает его благоприятным для данных микробиома.

Из клинических сопутствующих заболеваний, зарегистрированных у детей с РАС, проблемы с ЖКТ являются одними из наиболее распространенных. Диарея, запор и боль в животе – наиболее часто регистрируемые симптомы ЖКТ в популяции с РАС, но у многих из них чередуются запоры и диарея, поэтому эти категории часто недостаточны для описания симптомов со стороны желудочно-кишечного тракта с течением времени. Тем не менее консистенция стула (запор/диарея) была отмечена как главная ковариата фекального микробиома и, как было показано, затрудняет исследования типа «случай–контроль». Неудивительно, что обсуждаемые здесь работы предполагают, что многие из дифференциальных таксонов, которые, как считалось ранее, напрямую связаны с фенотипом РАС, вероятно, были артефактом, более тесно связанным с запорами и/или диареей у испытуемых. Наши результаты согласуются с недавним повторным анализом набора данных, включенного здесь. Только два ранее опубликованных исследования и наша внутренняя когорта сообщали информацию, касающуюся функции кишечника как в группе больных, так и в контрольной группе. Учитывая значительное влияние консистенции стула на популяции фекальных микроорганизмов и распространенность диареи и запоров в популяции пациентов с РАС, текущие и будущие исследования должны рассмотреть как минимум оценку собранных образцов на основе Бристольской шкалы кала и представление этого ковариатного индекса в статистическом анализе.

Рассматривая только лиц с нормальной функцией кишечника, мы смогли идентифицировать таксоны, более тесно связанные со статусом РАС, что невозможно в изолированных когортах из-за недостаточного количества статистических данных. Следует отметить, что три таксона были истощены у лиц с РАС по сравнению с контрольной группой НТ в нескольких наборах данных: Bacteroides stercoris t__190463 (уровень штамма), Granulicatella elegans (видовой уровень) и Massilioclostridium coli (видовой уровень). Несмотря на то что эти два вида имели низкую распространенность у исследуемых детей, они не были обнаружены у пациентов с РАС . Ранее сообщалось, что Bacteroides stercoris имеет более низкую относительную численность у детей с РАС по сравнению с детьми НТ, но более высокую относительную распространенность в другом исследовании. Здесь метаанализ оценил снижение относительной численности в популяции РАС после объединения сигналов из четырех различных наборов данных. Хотя доказательства, свидетельствующие о потенциальном механизме истощения B . stercoris при патологии РАС, еще не продемонстрированы, мы считаем, что идентифицированный штамм заслуживает дальнейшего изучения в качестве терапевтического средства. Метаанализ также показал, что Clostridium_M bolteae t__180407 (уровень штамма) был обогащен в исследуемых популяциях с РАС (3 набора данных). Clostridium bolteae была исследована в контексте РАС и более распространена у этих детей по сравнению с их сверстниками с НТ. Еще выше ее распространенность у лиц с синдромом Питта Хопкинса, тяжелой формой РАС с высокой частотой дисфункции желудочно-кишечного тракта. C . Bolteae продуцирует консервативный специфический капсульный полисахарид, который является иммуногенным у кроликов и был в центре внимания усилий по разработке вакцины против РАС . Хотя эти результаты являются многообещающими, необходимы дополнительные доказательства, поскольку относительно небольшое количество наборов данных подтвердило результат в этом исследовании, а результаты по уровню деформации могут быть искажены гетерогенностью между исследованиями.

Возраст является еще одной ковариатой, имеющей огромное значение и актуальность для здоровья и статуса микробиома, особенно у детей младшего возраста. Микробиом кишечника начинает напоминать микробиом взрослого человека примерно в возрасте трех лет, но данные свидетельствуют о дальнейшем его созревании в течение более длительного периода. Исследования РАС непреднамеренно были нацелены на детей широкого возрастного диапазона, и, к сожалению, возрастные различия в микробиоме кишечника в каждой исследуемой группе, вероятно, влияют на результаты и искажают выводы между исследованиями. Семь из 10 исследований, рассмотренных в настоящем документе, гарантировали, что группы случая и контрольная группы были сопоставимы по возрасту, хотя ни в одном из них не упоминался контроль возраста в статистическом анализе, хотя дети дошкольного возраста (2–4 года) и подростки (13–17 лет) оценивались в одном и том же исследовании. Недавний анализ более 2500 человек показал, что ассоциации заболевания и микробиома зависят от изучаемой возрастной группы, и что поправка на возраст улучшает обнаружение микробов, действительно имеющих отношение к фенотипу заболевания. Хотя это продемонстрировано на примере взрослых, вполне возможно, что эта парадигма применима к детям и подросткам, которые быстро растут и взрослеют. Наши дифференциальные результаты у детей младшего возраста и подростков подтверждают мнение о том, что микробиом различается в зависимости от возраста и у невзрослых популяций.

Наши результаты показывают, что численность бактериальных таксонов, ассоциированных с аутизмом, различается в зависимости от пола. Из-за примерно в четыре раза большей распространенности диагнозов РАС у мужчин по сравнению с женщинами исследуемые популяции часто предвзяты и несбалансированы в отношении пола. Мужчины составили 70–89,5% обследованных когорт, что указывает на то, что ассоциации микробиома, зависящие от пола, было сложно оценить в ранее проводимых исследованиях. Используя метааналитические подходы, мы смогли показать, что пол оказывает еще большее влияние на микробиом у детей с РАС, чем у детей с типичным развитием. Кроме того, связь между фекальными микробиомами и РАС была сильнее у женщин по сравнению с мужчинами. В соответствии с нашими выводами (тест Адониса), предыдущие исследования не сообщали об отсутствии связи между структурой микробного сообщества кишечника и полом у здоровых детей. Однако мы обнаружили несколько таксонов, которые были по-разному распространены среди лиц мужского и женского пола НТ, и эти различия были более значительными у мальчиков и девочек с РАС, но только три штамма были значимыми в обеих группах. Эти результаты говорят о том, что недавние исследования вариаций РАС-микробиома, все из которых основаны преимущественно на мужчинах, не могут быть обобщены в женской популяции.

Ограниченный размер выборки большинства исследований, включая, но не ограничиваясь теми, которые рассматривались в этом всестороннем анализе (n < 100 в девяти когортах; n < 50 в 5 когортах), резко ограничивает статистическую мощность и, следовательно, экспериментальную разрешаемость. Учитывая только степень вариативности, наблюдаемую в популяции людей с РАС, и количество искажающих факторов, которые необходимо устранить, становится совершенно очевидным, что более крупные исследования оправданы для улучшения статистической мощности и укрепления последующих выводов и заключений. Представленные здесь результаты убедительно свидетельствуют о том, что опросы, изучающие простые когорты случай–контроль, не подходят для изучения взаимосвязи между нарушениями микробиома кишечника и фенотипом РАС. Эта работа подчеркивает острую необходимость систематического сбора, курирования и представления подробных метаданных. Также очевидно, что статистические методы, используемые для оценки величины эффекта между случаями заболевания и контрольной группой, должны включать в себя корректировки, чтобы более точно учитывать возраст, пол и консистенцию образца стула. Другие искажающие факторы, которые не были учтены в нашем анализе из-за неадекватной отчетности, включают диету и лекарства. Диетические предпочтения и использование лекарств являются сильными ковариатами кишечного микробиома и особенно актуальны для исследований РАС, где пациенты часто имеют чрезвычайную избирательность в пище и сопутствующие заболевания, требующие фармакологического лечения.

Наше исследование показывает, что микробиомы кишечника в популяции с РАС демонстрируют заметную гетерогенность, что было установлено в отношении клинических проявлений расстройства. Высокая внутригрупповая вариабельность приводит к артефактам и маскирует истинные взаимосвязи между РАС и микробиомом. Поскольку проведение популяционных исследований РАС может быть трудным, мы продемонстрировали метааналитические подходы с сопутствующей корректировкой, чтобы выявить кишечные бактериальные нарушения, непосредственно связанные с симптоматикой РАС. Это существенный прорыв в понимании популяции пациентов и связанных с ними сопутствующих заболеваний, который поможет создать персонализированную терапию на основе микробиома.