Оценка способности нейтрофилов к окислительному взрыву – дигидрородаминовый тест, проточная цитометрия (Neutrophil Oxidative Burst, Dihydrorhodamine (DHR) Flow Cytometric Test)

Синонимы: Бактерицидная активность крови; Родаминовый тест, альтернатива НСТ-теста.

Burst-test.

Краткое описание исследования «Оценка способности нейтрофилов к окислительному взрыву – дигидрородаминовый тест, проточная цитометрия»

Дигидрородаминовый тест применяют для выявления дефектов фагоцитоза, связанных с нарушением окислительного метаболизма нейтрофилов. Исторически в качестве скринингового теста для диагностики дефектов окислительного метаболизма нейтрофилов применяли пробу восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). В настоящее время предпочтительным является использование метода проточной цитометрии с применением дигидрородамина.

Первичные иммунодефициты – это врожденные нарушения системы иммунитета, обусловленные генетическими дефектами одного или разных ее звеньев (клеточного и гуморального иммунитета, фагоцитоза, системы комплемента). Пациенты с первичными иммунодефицитами начально выявляются по клиническим проявлениям – истории повторяющихся инфекций. Характерные инфекционные агенты указывают на то, какая часть иммунной системы может быть нарушена.

Среди дефектов фагоцитоза такие варианты первичного иммунодефицита, как дефицит миелопероксидазы (МПО, MPO), хроническая гранулематозная болезнь, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы связаны с нарушением способности к продукции и аккумуляции нейтрофилами реактивных форм кислорода (окислительному взрыву), что нарушает механизм уничтожения фагоцитированных патогенов. Вследствие этого наблюдается недостаточный контроль над инфекционным процессом.

Основными формами фагоцитарной дисфункции, связанными с нарушением продукции АФК являются:

• Хроническая гранулематозная болезнь – первичное иммунодефицитное состояние, связанное с наследственным нарушением бактерицидной функции фагоцитов вследствие дефицита различных ферментов каскада НАДФ-оксидазы, генерирующего активные формы кислорода, необходимые для уничтожения бактерий. Выделяют Х-связанную и аутосомно-рецессивную формы. Обычно проявляется в течение раннего детства, но у некоторых пациентов может проявиться позже. Приводит к тяжелым рецидивирующим бактериальным и грибковым инфекциям, которые в отсутствие лечения приводят к образованию гранулем. Характерны инфекции, вызванные каталаза-положительными организмами (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Serratia, Klebsiella, Pseudomonas), инфекции легких, абсцессы печени, остеомиелит, хронические гранулемы, в т. ч. ротовой полости и лица. Может напоминать воспалительные заболевания кишечника и приводить к мальабсрбции и обструкции кишечника.
• Первичный дефицит миелопероксидазы – достаточно распространенный дефект фагоцитоза. Связанное с ним нарушение бактерицидных процессов в фагоцитах нередко протекает клинически бессимптомно, за исключением людей с сахарным диабетом (проявляется рецидивирующими тяжелыми инфекциями Candida).
• Дефицит глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы – дефект функции этого фермента нарушает работу НАДФ-системы окислительного метаболизма. Развитие заболеваний сходно с хронической гранулематозной болезнью при 1-5% от нормальной активности фермента. Но большинство вариантов мутаций характеризуются 20-50% снижением активности фермента и отсутствием дефектов фагоцитоза. Часто встречается гемолитическая анемия.

Возможны также вторичные (приобретенные) изменения окислительного метаболизма нейтрофилов, в том числе вследствие дисрегуляции и дефицита ферментных систем при различных острых (например, сепсис и системный воспалительный ответ, ожоги) или хронических (например, диабет) патологических состояниях.

Дигидрородаминовый тест был разработан для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов посредством измерения окислительного взрыва после стимуляции нейтрофилов бактериями (в данном случае E. coli), методом проточной цитометрии.

В процессе стимуляции нейтрофильных гранулоцитов бактериями E. coli или специфическим агентом – ФМА (форбол-12-миристил-13-ацетат) активируется NADPH-оксидаза, которая опосредует продукцию активных форм кислорода (RAS – АФК). Они в свою очередь окисляют добавленный в пробирку дигидрородамин, превращая его во флуоресцентный родамин 123, который детектируется на проточном цитометре.

С какой целью выполняют исследование

Тест назначают с целью выявления нарушений в оксидативной (бактерицидной) функции нейтрофилов.

Литература

1. Кузьменко Н. Б., Щербина А. Ю. Классификация первичных иммунодефицитов как отражение современных представлений об их патогенезе и терапевтических подходах //Российский журнал детской гематологии и онкологии. – 2017. – №. 3. – С. 51-57.
2. Спикетт Г. Клиническая иммунология и аллергология: оксфордский справочник/пер. с англ. проф. Н. И. Ильиной //М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2019. – С. 134-136.
3. Щербакова О. В. Первичные иммунодефицитные состояния, имитирующие воспалительные заболевания кишечника: клинические аспекты и проблемы дифференциальной диагностики //Альманах клинической медицины. – 2023. – Т. 51. – №. 8. – С. 456-468.
4. Юхачева Д. В. и др. Гранулематозное воспаление в манифестации хронической гранулематозной болезни: клинический случай //Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. – 2019. – Т. 18. – №. 4. – С. 99-104.
5. Abraham R. S., Aubert G. Flow cytometry, a versatile tool for diagnosis and monitoring of primary immunodeficiencies //Clinical and Vaccine Immunology. – 2016. – Т. 23. – №. 4. – С. 254-271.
6. McCusker C., Upton J., Warrington R. Primary immunodeficiency //Allergy, Asthma & Clinical Immunology. – 2018. – Т. 14. – С. 1-12.
7. Sikora J. P. et al. Respiratory burst and tnf-α receptor expression of neutrophils after sepsis and severe injury-induced inflammation in children //International Journal of Environmental Research and Public Health. – 2021. – Т. 18. – №. 4. – С. 2187.
8. Материалы фирмы-производителя реагентов (Exbio, Чехия).

Правила подготовки к исследованию

Основные правила подготовки

• Желательно воздержаться от приема пищи 3-4 часа до исследования. Воду пить можно.
• Накануне исследования необходимо исключить повышенные психоэмоциональные и физические нагрузки (спортивные тренировки), прием алкоголя, за час до исследования – курение.

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения: %, отношение.

Референсные значения

Количество гранулоцитов, проявляющих окислительную активность: 90,0-100,0% (при активации E. coli).

Индекс стимуляции с E. coli: >30,0.

Индекс стимуляции с PMA: >30,0.

Трактовка результатов исследования «Оценка способности нейтрофилов к окислительному взрыву – дигидрородаминовый тест, проточная цитометрия»

• Сниженный индекс стимуляции и E. coli, и ФМА может указывать на наиболее частый дефект – дефицит МПО.
• Отсутствие или низкий эффект стимуляции и E. coli, и ФМА менее часто может указывать на хроническую гранулематозную болезнь (индекс стимуляции может зависеть от типа мутации). Может быть показано генетическое тестирование (см. тест № 7890CYBB).
• У женщин наличие двух субпопуляций гранулоцитов с разной интенсивностью окислительного взрыва может указывать на дефект в Х-связанном гене.
• Иногда снижение респираторного взрыва может быть связано с низкой активностью глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы.
• Низкая доля гранулоцитов с респираторным взрывом может быть следствием высокого % поврежденных гранулоцитов и указывать на нарушения преаналитики.
• Отрицательный ответ на стимуляцию E. coli при наличии положительного ответа на стимуляцию ФМА может указывать на дефект адгезии или поглощения при фагоцитозе (либо быть следствием присутствия в пробе антикоагулянтов цитрата или ЭДТА).